Ensayo de flujo lateral basado en nanocápsulas de oro para la detección de la enfermedad de Chagas
Investigadores que se desempeñan en distintas instituciones de New York y Ecuador, publicaron en la edición del 27 de junio de 2022 de The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene, los resultados de un ensayo de flujo lateral basado en nanocápsulas de oro para la detección de la enfermedad de Chagas en el lugar de atención*
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Para introducir el tema los autores recuerdan que la infección por el parásito protozoario Trypanosoma cruzi , causante de la enfermedad de Chagas, afecta aproximadamente a entre 6 y 7 millones de personas en todo el mundo y causa más de 10.000 muertes al año.
Es una enfermedad transmitida principalmente por insectos triatominos.
La transmisión vectorial ocurre en regiones endémicas de las Américas donde estos insectos mantienen ciclos de vida selváticos, peridomésticos y domésticos.
Si la enfermedad de Chagas no se trata en sus primeras etapas, la infección pasa a una fase crónica silenciosa que puede persistir durante décadas o toda la vida.
La enfermedad de Chagas crónica puede manifestarse entre 10 y 30 años después de la exposición con complicaciones cardiovasculares, digestivas, neurológicas o mixtas irreversibles.
Es importante destacar que, durante el estado latente, los individuos infectados pueden transmitir la enfermedad a otros a través de vías no vectoriales, que incluyen transfusión de sangre, trasplante de órganos y transmisión congénita.
Garantizar el diagnóstico temprano de la enfermedad de Chagas es esencial para el control de la transmisión y el manejo clínico.
Desafortunadamente, los métodos de detección actuales no sólo carecen de priorización y cobertura inadecuada tanto en entornos endémicos como no endémicos, sino que siguen siendo un desafío importante.
Durante la fase aguda de la enfermedad, la parasitemia sanguínea puede detectarse mediante métodos de microscopía directa o mediante técnicas de cultivo.
Sin embargo, a medida que avanza la enfermedad, el diagnóstico es más difícil y se basa en la detección de anticuerpos anti- T. cruzi , principalmente IgG, mediante métodos serológicos estándar, como el ensayo de inmunofluorescencia indirecta (IFI), el ensayo de hemaglutinación indirecta (HAI) y ELISA. .
Como las pruebas de Chagas a menudo arrojan resultados no concluyentes, las guías actuales recomiendan evaluar los casos sospechosos mediante al menos dos pruebas de diagnóstico.
En el caso de que ambas pruebas serológicas sean confirmatorias, las dos pruebas deberán detectar antígenos diferentes.
Dado que la enfermedad de Chagas afecta con mayor frecuencia a poblaciones marginadas que viven en entornos de recursos limitados, es necesario no sólo mejorar las herramientas de diagnóstico estándar, sino también promover una mejor cobertura de diagnóstico mediante el desarrollo de sistemas de punto de atención confiables, asequibles y pruebas precisas..
Si bien se ha desarrollado un conjunto diverso de herramientas de diagnóstico rápido, sólo cuatro pruebas han sido aprobadas por la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) para uso diagnóstico, que incluyen el sistema de prueba ELISA ORTHO T. cruzi (Ortho Clinical Diagnostics, Raritan, Nueva Jersey), el kit ELISA de Hemagen Chagas (Hemagen Diagnostics, Inc. ., Columbia, MD), Wiener Chagatest Recombinante v. 3.0 ELISA (Wiener Laboratories, Rosario, Argentina) y InBios Chagas Detect Plus (CDP) Rapid Test (InBios International, Inc., Seattle, WA).
Por lo tanto, aún se necesitan pasos asequibles, fáciles de usar, que dependan mínimamente del operador y herramientas de diagnóstico fácilmente interpretables para una mejor detección, manejo y control de la enfermedad de Chagas, tanto en entornos endémicos como no endémicos.
Para abordar la necesidad de una prueba de campo para la enfermedad de Chagas, se buscó determinar el potencial de diagnóstico de las nanocásulas de oro (AuNS).
Las nanocapas de oro son una clase de nanopartículas plasmónicas compuestas por un núcleo de sílice dieléctrico rodeado por una fina capa de oro.
Las nanopartículas plasmónicas son partículas metálicas de dimensiones nanométricas, cuya densidad electrónica puede acoplarse con la radiación electromagnética de cierta longitud de onda, debido a la naturaleza de la interfaz metal-dieléctrico entre el medio y las partículas
Su composición única permite propiedades ópticas versátiles de absorción y dispersión, que tienen un gran potencial biomédico para aplicaciones terapéuticas y de diagnóstico mejoradas.
En este artículo, se informa el desarrollo de un ensayo de flujo lateral (LFA) que emplea AuNS de 150 nm de diámetro conjugado con una matriz sintética de antígenos recombinantes de T. cruzi .
Los ensayos de flujo lateral combinan un sistema integral de análisis basado en anticuerpos en una única tira de membrana y permiten la detección de diversos analitos en solo unos minutos.
Los dispositivos de flujo lateral (LFD por sus siglas en inglés) son tiras reactivas inmunocromatográficas rápidas.
Al igual que sucede con otros ensayos inmunológicos, el método de ensayo se basa en la reacción antígeno-anticuerpo.
Para realizar el análisis, la tira reactiva se sumerge en la muestra de líquido. Si el analito está presente en la muestra, aparece una línea de color en la tira reactiva después de 5 minutos.
Esta evaluación visual permite el análisis cualitativo y semicuantitativo.
Mediante un lector LFD, las tiras reactivas también se pueden analizar de forma cuantitativa.
Además de la rapidez de los resultados y la sencilla manipulación, los ensayos de flujo lateral tienen otras ventajas, como su bajo coste y elevados niveles de validez.
Estas moléculas recombinantes representan antígenos que se encuentran en las diferentes etapas morfológicas de T. cruzi y, por lo tanto, podrían obviar la necesidad de múltiples pruebas serológicas que se basan en un único antígeno o lisados de parásitos.
Este diseño de prueba de concepto demostró que esta prueba cualitativa en el lugar de atención puede obtener resultados con un rendimiento analítico similar al de los ensayos serológicos estándar, pero con un procesamiento mínimo de la muestra y un tiempo de incubación/respuesta de 15 minutos.
La enfermedad de Chagas es una infección parasitaria desatendida y un importante problema de salud pública en las Américas.
Sigue estando subdiagnosticado en los Estados Unidos y a nivel internacional debido a la falta de pruebas asequibles y a las disparidades en la atención médica, particularmente para aquellos en mayor riesgo.
Se describe un inmunoensayo de flujo lateral de prueba de concepto que emplea un multiantígeno de Chagas recombinante conjugado con nanocásulas de oro (AuNS) para detectar anticuerpos IgG anti-Chagas humanos circulantes.
Este es uno de los primeros inmunoensayos de flujo lateral que aprovecha la mayor superficie de AuNS en comparación con las nanopartículas que pueden ayudar a amplificar señales de baja magnitud.
Los resultados se compararon con 42 muestras de suero de Chagas positivas y negativas, de las cuales un subconjunto de 27 muestras se validó frente a un ELISA (Hemagen ®).
La sensibilidad y especificidad de este ensayo fueron del 83% y 95%, respectivamente.
Estos resultados sugieren que una prueba rápida basada en AuNS para la enfermedad de Chagas podría facilitar la detección/diagnóstico en el campo con un rendimiento comparable al de los métodos comerciales.
Debido a la amplia diversidad genética y antigénica de T. cruzi , ninguna prueba ha demostrado ser óptima para la evaluación de la enfermedad de Chagas.
Para evitar resultados de pruebas no concluyentes, se recomienda la evaluación concomitante de muestras mediante al menos dos ensayos inmunológicos diferentes.
Pero incluso cuando se cumplen estas recomendaciones, la alta heterogeneidad en la realización de las pruebas estándar puede dar como resultado un diagnóstico de Chagas mal clasificado o no concluyente.
Un factor conocido que contribuye a la variabilidad del rendimiento de las pruebas es la implementación de diferentes antígenos de T. cruzi y sus respectivas preparaciones antigénicas.
Los estudios que comparan preparaciones de antígenos han observado un mayor consenso entre los sueros positivos y una menor reactividad cruzada cuando se utilizan péptidos quiméricos recombinantes de T. cruzi .
En función de su potencial para mejorar el rendimiento de los ensayos, varios grupos de investigación han considerado el empleo de diferentes construcciones de proteínas sintéticas para mejorar la evaluación de la enfermedad de Chagas.
Este estudio también buscó evaluar la integración de un polipéptido quimérico recombinante que porta cuatro antígenos de Chagas previamente caracterizados, pero utilizando un diseño novedoso de LFA y una nueva clase de nanopartícula plasmónica.
Se desarrolló una LFA de prueba de concepto que emplea AuNS de 150 nm conjugado con un multiantígeno de Chagas recombinante para la detección cualitativa de anticuerpos IgG anti-Chagas.
Al evaluar 42 muestras de Chagas positivas y negativas previamente caracterizadas, el AuNS-LFA mostró un valor predictivo positivo del 81,4% y un valor predictivo negativo del 97,7%.
Se utilizó un subconjunto de muestras para validar el ensayo frente a un ensayo ELISA comercial aprobado por la FDA, que previamente se ha documentado que tiene una sensibilidad y especificidad que oscilan entre 87,7% y 100% y 99,68% y 100%, respectivamente.
Durante estos experimentos de validación, la prueba de Hemagen mostró una sensibilidad del 91% y una especificidad del 100%.
Este rendimiento fue superior al de la prueba AuNS-LFA, que demostró una sensibilidad y especificidad del 83% y 95%, respectivamente, y una precisión general del 95% en la detección de anticuerpos IgG anti- T. cruzi circulantes.
Otros estudios que compararon el rendimiento de los mismos cuatro ensayos aprobados por la FDA para detectar Chagas crónico han mostrado resultados consistentes con AuNS-LFA.
Esto confirma aún más la gran heterogeneidad que existe entre las pruebas y la necesidad de mejores herramientas de diagnóstico rápidas, sensibles y confiables.
Los resultados, aquí, resaltan la utilidad potencial de una prueba rápida como AuNS-LNF para identificar la exposición aT. cruzi, particularmente en entornos con recursos limitados, donde el acceso a herramientas de prueba intensivas y personal capacitado es limitado.
Para comparar la utilidad diagnóstica de AuNS con nanopartículas de oro estándar (AuNP), se conjugó el polipéptido quimérico de Chagas con AuNP y se evaluó su desempeño en un ensayo puntual (datos no mostrados).
La evaluación inicial del diseño de LFA utilizando AuNP arrojó señales muy débiles o nulas en las líneas de prueba o de control y, por lo tanto, impidió una comparación directa entre las tiras AuNP- y AuNS-LFA.
Los autores sospechan que las diferencias observadas en la señal se deben a incompatibilidades con la conjugación y/o el diseño del LFA.
Cabe destacar que la mayoría de los formatos de LFA conjugan anticuerpos antihumanos policlonales o monoclonales con sus nanopartículas y dispensan antígenos proteicos en la membrana de nitrocelulosa.
Por el contrario, se conjugó la proteína quimérica con AuNS y se utilizó un anticuerpo antihumano como línea de prueba.
Una ventaja importante de esta configuración modificada fue que se requería menos proteína quimérica para obtener una lectura de señal de los resultados.
Otra ventaja de utilizar un polipéptido quimérico marcado fue que permitió utilizar un anticuerpo anti-marca como línea de control.
Hasta donde sabemos, la implementación de una proteína marcada como componente clave del formato sándwich LFA es exclusiva del diseño AuNS-LFA.
Esta es una práctica que no sólo redujo el tiempo y el esfuerzo para encontrar pares de anticuerpos sino que también mitigó el costo de los materiales de ensayo.
El coste de un único prototipo de tarjeta AuNS-LFA fue de 14,75 dólares (dólares estadounidenses). Cada tarjeta puede producir hasta 75 tiras reactivas (4 cm × 0,4 cm), lo que se traduce en un costo de $0,20 en materiales por cada evaluación de Chagas.
Dado que la prueba de diagnóstico rápido estimada para la enfermedad de Chagas cuesta entre 4 y 7 dólares por determinación única, AuNS-LFA es una alternativa asequible para la vigilancia de Chagas.
Aunque aún se necesitan estudios adicionales para comprender completamente la utilidad clínica de AuNS-LFA, estos datos sugieren que dichas plataformas pueden proporcionar una alternativa sensible y específica a los ensayos inmunológicos estándar.
Esta tecnología, destinada al diagnóstico rápido y preciso de la enfermedad de Chagas, conlleva muchas ventajas potenciales en relación con los métodos serológicos estándar.
En primer lugar, la LFA es un método de diagnóstico rápido que es asequible, utiliza un mínimo de muestra, tiene una rápida rotación de resultados y es fácil de realizar e interpretar con una formación mínima.
En segundo lugar, las propiedades ópticas únicas de AuNS permiten una extinción más fuerte por partícula.
Esto se traduce en una mayor sensibilidad en un formato LFA en comparación con las omnipresentes nanoesferas de oro coloidal de 40 nm.
En tercer lugar, el uso de un polipéptido recombinante sintético que porta cuatro antígenos de Chagas no sólo ofrece una mayor sensibilidad en comparación con las pruebas basadas en un solo antígeno o lisado de parásito, sino que también podría eliminar la necesidad de utilizar múltiples pruebas de un solo antígeno para confirmar la enfermedad de Chagas.
Por último, AuNS-LFA representa una importante reducción de costes en comparación con los métodos tradicionales.
En conjunto, estas características son de gran valor para supervisar el serodiagnóstico de la enfermedad de Chagas tanto en poblaciones de alto como de bajo riesgo; pero con el mayor impacto en entornos de recursos limitados, donde la enfermedad afecta predominantemente a poblaciones marginadas con acceso limitado o nulo a la atención médica.
La validación del ensayo estuvo limitada por el pequeño tamaño de la muestra de muestras seropositivas.
Sin embargo, los datos preliminares justifican estudios adicionales de plataformas de puntos de atención que emplean AuNS para comprender mejor su utilidad clínica y su desempeño en el campo.
* Medina-Rivera M, Cárdenas WB, Erickson D, Mehta S. Gold Nanoshells-Based Lateral Flow Assay for the Detection of Chagas Disease at the Point-of-Care. Am J Trop Med Hyg. 2022 Jun 27;107(2):323-327. doi: 10.4269/ajtmh.21-1119. PMID: 35895419; PMCID: PMC9393437.
